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白芸豆中α-淀粉酶抑制剂研究进展 

发布日期:2014-04-24 作者:屈洋 信息来源:宝鸡市农业科学研究所 查看次数:6765

  白芸豆(White kidney beans),生物学名为多花菜豆(Phaseolus vulgaris),属于一年生、缠绕或近直立草本。近年来,白芸豆的营养保健和药用价值得到广泛的研究,尤其是α-淀粉酶抑制剂的提取和应用对于治疗高血糖、高血脂和肥胖症具有重要意义。

  1α-淀粉酶抑制剂

  α-淀粉酶抑制剂(α-amylase inhibitorα-AI)是一种糖苷水解酶抑制剂,是一种纯天然生物活性物质,它存在于植物种子的胚乳中,对α-淀粉酶水解淀粉的生物化学反应有较强的抑制作用,国外把它称为“Starch blocker”(Murao A and Goto Y,1981.赵蓉等,2008)。

  天然存在的α-AI主要有3种类型,分别为(Jack Lee S C and Whitaket J,2000):微生物产带一个寡生物胺单位的含氮碳水化合物;微生物产多肽,如paim(来自微生物的猪胰α-淀粉酶抑制剂)和Haim(微生物起源人α-淀粉酶抑制剂);在豆类、谷类及其他较高等植物中发现的大分子蛋白质抑制剂。

  2 白芸豆中α-AI

  白芸豆属豆科,蝶形花亚科,菜豆族菜豆属。芸豆中首次报道α-AI源于1945年(Bowman,1998),白芸豆中提取的α-AI是一种具有N端糖基化的糖蛋白,作为一种热稳定的糖蛋白,α-AI是在内质网上合成,储存在液泡内,要经过蛋白水解酶水解去抑制作用才能成为有活性的α-AI。V. Le BerreA 等(1997)αAI-1对猪胰淀粉酶(PPA)的抑制作用是以一种受调配的非竞争性作用机制为基础的顿挫型,相应地αAI-1在PPA活性结合位点上的相互作用通过X射线研究得到清楚的证实。赫卫青等(2002)研究表明芸豆中发现的α-AI已有3种,分别是αAI-1、αAI-2和αAI-L,其中从芸豆中分离到的αAI-1,是由两个糖肽亚基α(7. 8 kD)和β(14 kD)组成,它能抑制猪胰腺淀粉酶(PPA)、人胰腺淀粉酶、人唾液腺淀粉酶和一些鞘翅昆虫四纹豆象、绿豆象、粉虫的α-淀粉酶。严哲等(2002)研究表明淀粉含量越高的植物果实,其α-AI含量越多。目前α-AI已经从豆类、小麦、野生苋属(表1)等植物种子中分离得到,其中从白芸豆中提取的α-AI具有较高的生物活性和高效价(Gibbs B F and Alli,1998)。

  α-AI对淀粉酶的抑制具有专一性,不同植物的淀粉酶抑制剂的抑制特性见表2。小麦和白芸豆中提取的α-AI对哺乳动物唾液及胰α-淀粉酶具有专一的抑制作用,大麦、小米、高粱和黑菜豆对昆虫淀粉酶具有专一的抑制作用。同时王文蒙等(2010)研究表明,白芸豆中提取的α-淀粉酶抑制剂对哺乳动物唾液及胰α-淀粉酶有较强的抑制作用,并且这种抑制作用使不可逆的,小麦麸皮中提取的α-淀粉酶抑制剂对哺乳动物唾液及胰α-淀粉酶的抑制是混合非竞争性抑制。

表1不同作物的α-淀粉酶抑制剂的生物活性

来源

淀粉含量

(g%)

活性

(KIU/mg)

来源

淀粉含量

(g%)

活性(KIU/mg)

粳米

76.2

35.6

籼米

73.1

35.2

糯米

76.4

36.5

绿豆

57.2

28.2

小麦

74.1

35.1

蚕豆

48.2

24.6

面粉

62.5

30.2

豌豆

56.4

28.0

小米

71.4

35.0

土豆

17.6

8.6

玉米

68.9

34.1

板栗

44.3

24.8

荸荠

20.7

9.6

花生

24.7

11.2

大豆

25.2

13.5

红薯

32.4

30.7

芸豆

59.6

95

-

-

-

 

表2 不同作物淀粉酶抑制剂的理化性质及抑制特性

来源

分子量(KDa)

亚基

碳水化合物

(%)

PI

选择抑制性

小麦

5.1

4

-

-

哺乳动物唾液及胰α-淀粉酶

大麦

2.0

-

-

7.3

昆虫淀粉酶

小米(淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂)

1.33

1

-

> 10

昆虫淀粉酶

高粱

2.1

2

-

-

昆虫淀粉酶

黑菜豆

4.9

4

8.6-13

-

昆虫淀粉酶

白菜豆

4.0

2

9.1

-

哺乳动物唾液及胰α-淀粉酶

  3 白芸豆中α-淀粉酶抑制剂的提取和纯化

  Bernard F.Gibbs(1998)将白芸豆水浸提(分别pH2, pH7和pH10条件下),过滤、浓缩后反相HPLC进行提纯。根据Marshal和Lauda的方法(2005),芸豆籽粒粉经酸提取,硫酸铵盐析(35% -65%饱和), DEAE-cellulose柱层析, Biogel P-100柱层析来实现提纯。我国学者也进行了相关方面的研究,杨明琰(2008)研究表明:白芸豆粉碎过40目筛得到芸豆粉;加5倍水室温浸提2小时,共3次,过滤,合并滤液;滤渣(弃),滤液加热70℃除杂,离心,沉淀(弃);上清液加食用乙醇至终浓度为70%,离心,上清液(弃);得到沉淀,干燥,得到白芸豆α-AI粗品(淡黄色固体粉末);白芸豆α-AI粗品加入适量缓冲液溶解;CMII-Celluse 离子柱层析,梯度洗脱,检测A280及淀粉酶抑制活性;收集蛋白峰与活性峰重合的洗脱液,透析,浓缩,冷冻干燥;白芸豆α-AI样品1,适量缓冲液溶解;Sephadex G-75凝胶柱层析,缓冲液洗脱,检测A280及淀粉酶抑制活性;收集蛋白峰与活性重合的洗脱液,透析,浓缩,冷冻干燥;白芸豆α-AI样品2,适量缓冲液溶解;ConA-Sepharose 亲和柱层析,洗脱,检测A280及淀粉酶抑制活性;收集活性部分,透析,浓缩,冷冻干燥;白芸豆α-AI纯品。王文蒙(2010)研究表明白芸豆:水="1:1(100g" 白芸豆,800mL 纯净水),24h 浸泡过夜,粉碎搅拌4h,得出1.84g 干燥样品,配置成浓度为5mg/ml 的溶液,其抑制活力91U/ml,比活力为22.2U/mg,总活力为33488U,最终抑制收率为71.9%;DE 纤维素离子交换柱层析,洗脱液采用pH="4.5" 的醋酸盐缓冲液,0-1mol/L 的NaCl 梯度,流速1mL/min;葡聚糖凝胶G75 层析,洗脱液不变,流速0.2mL/min。赵荣(2010,2013)研究了白芸豆α-AI提取和纯化条件如下:在浸提工艺单因素试验的基础上进行四因素三水平的正交试验,进而确定了最佳提取工艺条件为: 取过60目筛的白芸豆籽粒粉碎原料100g,按料液比(W/V) l:6加入1.5%NaCI溶液浸提过夜,离心(10000 rpm,20min 4℃)取上清70℃水浴15min,冷至室温后离心,上清液加70%乙醇4℃醇沉。进行了最佳浸提工艺验证,α-AI抑制剂的抑制活性均值65%(n="3);对浸提工艺获得的白芸豆α-AI抑制剂粗品进行DEAE-Cellulose离子交换树脂柱层析洗脱,获得白芸豆α-AI抑制剂样品,该样品得率0.37%,测定其抑制活性79.3%;进而通过Sephadex" G-75凝胶柱层析对所提取的白芸豆。α-AI抑制剂样品进行了进一步的分离纯化,获得了白芸豆α-AI抑制剂产品(淡黄色粉末状),得率0.12%。

  杨明琰(2008) 纯化后的α-AI相对分子量36KD,抑制活性9.41 KIU/mg;王文蒙(2010)得到纯化后的α-AI,分子量分别为35kD,30kD,抑制活性3.34 KIU/mg;赵荣(2010)纯化后的α-AI相对分子质量36KD,结构均一的糖蛋白,其抑制活性为9.04 KIU/mg。不同的研究人员研究结果表明,纯化后的α-AI具有较高的抑制活性,其分子质量约为36KD。

  4 应用前景

  4.1降糖、降脂和肥胖的治疗

  淀粉是饮食中的碳水化合物的主要组成,经唾液、胰淀粉酶水解生成麦芽糖,再以葡萄糖的形式在肠道内吸收。α-AI通过对淀粉酶水解淀粉的抑制作用而发挥效应,并经胃肠道排出体外(彭游,2012),因此不必进入血液循环系统,不抑制食欲,无副作用。

  Layer P等(1985)和Turcotte G E等(1994)研究表明α-AI以哺乳动物消化道内的α-淀粉酶为靶酶,通过抑制其活性,阻止食物中碳水化合物的消化吸收,减少糖分摄取,降低血糖和血脂含量水平,进食后不产生高血糖症,从而使胰岛素分泌减少,脂肪合成降低,体重减轻,所以可以治疗高血糖、高血脂、肥胖病等病症。Lankisch M等(1998)研究结果表明,小麦α-AI可以减少碳水化合物的吸收,降低餐后血糖峰值,可用于辅助治疗Ⅱ型糖尿病;张琪等(2005)研究结果表明α-AI能调节血脂平衡,预防高脂血症及动脉粥样硬化的生成,对已形成的高脂血症也有一定的治疗效果。Tormo M A等(2006)通过口服白芸豆α-AI,研究其对Ⅱ型糖尿病大鼠的降糖效果,结果表明白芸豆α-AI可以显著提高高血糖大鼠消化道内糖代谢酶的活性,降低高血糖大鼠的空腹血糖;张琪等(2006)研究结果表明,小麦α-AI对糖尿病小鼠有降血糖作用,其机制与抑制小肠内各肠段的麦芽糖和蔗糖酶活性有关。吴永宏等(2006)研究结果表明,高中剂量组的α-AI能有效减少营养性肥胖大鼠的质量和体内脂肪,且减肥效应与剂量呈正相关;经过初步纯化的、剂量足够的α-AI在胃肠道中可以抑制肠胃道内唾液淀粉酶和胰淀粉酶的活性,使食物中主要的碳水化合物(淀粉)的消化作用阻碍或延缓,并使食物中淀粉类物质的分解吸收降低,从而起到减低血糖、血脂的作用,抑制血糖浓度的升高,可以有效地配合糖尿病人的饮食治疗,因此减少淀粉分解为单糖从而减低餐后血糖水平对糖尿病人的好处是显而易见的(吕凤霞和陆兆新,2012)。对于肥胖患者,可减少糖向脂肪转化,延缓肠道的排空,增加脂肪的消耗以减少体重(赵荣,2010)。杨明琰(2008)研究表明α-AI无急性毒性反应,可以作为食物和药物使用,建议人体服用量150mg/kg时对降血糖和血脂效用明显,并且这种作用呈现一定的量效关系;张晓琦等(2008)研究表明从白芸豆中提取分离得到的α-AI对高血糖的大鼠具有明显的降糖作用,当剂量为300mg/kg时降糖效果更明显;陈一昆等(2012)研究表明α-AI对降低肥胖大鼠体重、内脏脂肪及胆固醇有显著作用。因此,α-AI可以作为防止和治疗肥胖症、脂肪过多症、动脉硬化症、高血脂及糖尿病等疾病的有效药物,同时还需要进一步的临床验证。

  目前,以α-AI为主要成分的将糖类药物已经开发阿卡波糖(Acarbose)(吴建波等,2002)、伏格列波糖(Voglibose)(森木繁夫,1996)和米格列醇(Miglitol)(沈佳佳等,2005),以白芸豆中提取的α-AI生产的减肥药物产品在北美和日本十分畅销(Miyazaki T等,1996)。国内人口主要以消费淀粉类产品作为主要的食物类型,因此α-AI为主要成分的降脂、降糖药物具有巨大的市场潜力。

  4.2农业制剂

  Lajolo F M和Filho F F(1985)研究表明白芸豆中一些抑制剂为一种糖蛋白,带有相同的肽或不同的多肽,能抑制哺乳动物和昆虫淀粉酶活性,但不抑制植物中α-淀粉酶的活性。李海燕等(2000)报道白芸豆中至少含有两种α-AI和植物凝集素中(phytohemagglutinin,PHA),其中PHA是芸豆中含量较多的一种凝集素,但是α-AI却在抑制害虫方面起了决定性作用,因此芸豆的种子很少受到昆虫的侵害。大部分对植物有害的昆虫利用消化酶降解植物淀粉和蛋白质等,侵蚀植物组织和破坏生长,给农业生产造成严重的危害,昆虫淀粉酶抑制剂可作为针对这类害虫强有力武器,并对其他有益昆虫和哺乳动物不产生毒害作用,没有污染,解决了化学农药在减少虫害的同时引起的一系列生态问题(唐成康,2005)。因此白芸豆中所含的昆虫淀粉酶抑制剂在生物农药领域和植物抗虫基因工程领域的应用具有广阔前景。

  5 展望

  目前人类生活水平的提高,高血脂、高血糖以及肥胖症的患病率急剧上升,严重威胁人类的健康,这些疾病的防治和预防显得非常急迫。在高血糖、血脂和减肥方面,白芸豆中提取的高纯度α-AI疗效显著,可以有效的治疗和预防高血糖、血脂和肥胖等疾病。同时,白芸豆中具有α-AI可以专一抑制昆虫淀粉酶,对制造生物农药,减轻环境污染等方面应用前景广阔。因此,一方面要加强白芸豆品种的专一性选择,筛选提供优质专用的高含量的α-AI的品种,另一方面要加强白芸豆中α-AI的提取和纯化以及应用产品的开发,尤其在降糖、降脂药物和生物农药领域,其潜在的商业价值不可限量,市场潜力巨大。

 

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